Вакол нас шмат неапеваных герояў, якія здаюцца звычайнымі, але на самой справе яны ціха робяць вялікі ўнёсак у нашу жыццё. Пратэіназа К — гэта «неапеваны герой» у галіне малекулярнай дыягностыкі, хоць у параўнанні з «вялікімі і магутнымі» ў гэтай галіне пратэіназа К настолькі стрыманая, што мы доўга ігнаравалі яе важнасць. З пачаткам новай эпідэміі каранавіруса попыт на пратэіназу К рэзка ўзрос, а яе прапанова ў краіне і за мяжой значна адстае ад спажывання, і ўсе раптам зразумелі, наколькі важная пратэіназа К.
Для чаго патрэбна пратэіназа К?
Пратэіназа К — гэта серынавая пратэаза з пратэалітычнай ферментатыўнай актыўнасцю, якая можа падтрымліваць актыўнасць у шырокім дыяпазоне асяроддзяў (pH (4-12,5), буфер з высокім утрыманнем солі, высокая тэмпература 70°C і г.д.). Акрамя таго, актыўнасць пратэіназы К не інгібіруецца SDS, мачавінай, EDTA, гуанідыну гідрахларыдам, гуанідыну ізатыяцыянатам і г.д., а пэўная колькасць дэтэргента таксама можа павысіць актыўнасць пратэіназы К. Пратэіназа К мае мноства прымяненняў у медыцынскім лячэнні (дэзінфекцыя ад вірусаў і мікробаў), харчовых прадуктах (змякчэнне мяса), скуры (змякчэнне валасоў), вінаробстве (ачышчэнне спірту), падрыхтоўцы амінакіслот (дэградаванае пер'е), экстракцыі нуклеінавых кіслот, гібрыдызацыі in situ і г.д. Найбольш распаўсюджаным ужываннем з'яўляецца экстракцыя нуклеінавых кіслот.
Пратэіназа К можа ферменталізаваць усе віды бялкоў ва ўзоры, у тым ліку тыя гістоны, якія цесна звязаны з нуклеінавымі кіслотамі, так што нуклеінавыя кіслоты могуць вызваляцца з узору і трапляць у экстракт, што палягчае наступны этап экстракцыі і ачысткі. Пры выяўленні віруснай нуклеінавай кіслаты пратэіназа К з'яўляецца адным з важных кампанентаў раствора для адбору віруса. Пратэіназа К можа расшчапляць і інактываваць бялок абалонкі віруса, што бяспечней падчас стадыі транспарціроўкі і выяўлення; акрамя таго, пратэіназа К таксама можа расшчапляць РНКазу, якая прадухіляе раскладанне віруснай РНК і палягчае выяўленне нуклеінавых кіслот.
Імгненная слава пратэіназы К
Як у галіне навуковых даследаванняў, так і ў галіне дыягностыкі і дыягностыкі мікрафлоры, экстракцыя нуклеінавых кіслот з'яўляецца самым базавым эксперыментам, таму пратэіназа K заўсёды гуляла вельмі важную ролю. Аднак у мінулым пратэіназу K ведалі значна менш, чым яе ролю. У значнай ступені гэта было звязана з тым, што суадносіны попыту і прапановы пратэіназы K былі вельмі стабільнымі. Мала хто мог бы падумаць, што пастаўкі пратэіназы K будуць праблемай.
З пачаткам эпідэміі новага каранавіруса попыт на тэставанне нуклеінавых кіслот рэзка ўзрос. Па стане на канец чэрвеня 2020 года ў Кітаі было праведзена амаль 90 мільёнаў новых тэстаў на каранавірус, і гэтая лічба яшчэ больш трывожная ў глабальным маштабе. У эксперыментах па экстракцыі нуклеінавых кіслот рабочая канцэнтрацыя пратэіназы К складае каля 50-200 мкг/мл. Звычайна для экстракцыі ўзору нуклеінавай кіслаты патрабуецца каля 100 мкг пратэіназы К. У рэальных умовах, каб павысіць эфектыўнасць экстракцыі нуклеінавых кіслот, пратэіназа К часта выкарыстоўваецца ў большай колькасці. Выяўленне нуклеінавых кіслот новага каранавіруса прывяло да вялікага попыту на пратэіназу К. Першапачатковы баланс попыту і прапановы пратэіназы К быў хутка парушаны, і пратэіназа К імгненна стала важным матэрыялам для прафілактыкі эпідэмій.
Цяжкасці ў выпрацоўцы пратэіназы К
Нягледзячы на тое, што з развіццём эпідэміі людзі высока ацанілі важнасць пратэіназы К, выклікае сорам, што з-за яе нізкай даступнасці мала айчынных кампаній займаюцца вытворчасцю пратэіназы К. Калі людзі хочуць наладзіць вытворчасць пратэіназы К, падчас вытворчасці высветлілася, што пратэіназа К — гэта надзвычай асаблівы бялок. Пашырыць вытворчыя магутнасці пратэіназы К за кароткі прамежак часу надзвычай складана.
Масавае вытворчасць пратэіназы К сутыкаецца з наступнымі цяжкасцямі
1. Нізкая экспрэсія
Пратэіназа К можа неспецыфічна расшчапляць большасць бялкоў і выклікаць сур'ёзную таксічнасць для экспрэсуючай клеткі-гаспадара. Такім чынам, узровень экспрэсіі пратэіназы К звычайна вельмі нізкі. Скрынінг экспрэсійных сістэм і штамаў, якія высока экспрэсуюць пратэіназу К, звычайна патрабуе больш працяглага цыклу.
2. Рэшткі пігментаў і нуклеінавых кіслот
Маштабная ферментацыя ўводзіць вялікую колькасць пігмента і рэшткаў нуклеінавых кіслот гаспадара. Выдаліць гэтыя прымешкі з дапамогай простага працэсу ачысткі складана, а складаная ачыстка павялічвае кошт і зніжае хуткасць здабывання.
3. Нестабільнасць
Пратэіназа К недастаткова стабільная, яна можа ферменталізаваць сама сябе, і яе цяжка стабільна захоўваць пры тэмпературы 37°C на працягу доўгага часу без ахоўнага агента.
4. Лёгка выпадае ў асадак
Пры падрыхтоўцы ліафілізаванага парашка пратэіназы К, каб забяспечыць высокую канцэнтрацыю цвёрдых рэчываў пратэіназы К у ліафілізаваным парашку, неабходна дадаць ліафілізаваны ахоўны агент у высокай канцэнтрацыі, але калі канцэнтрацыя пратэіназы К дасягае 20 мг/мл і вышэй, лёгка ўтварае асадак, што стварае вялікія цяжкасці пры ліафілізацыі пратэіназы К з высокім утрыманнем цвёрдых рэчываў.
5. Вялікія інвестыцыі
Пратэіназа К валодае моцнай пратэазнай актыўнасцю і можа гідралізаваць іншыя пратэазы ў лабараторыі. Таму для даследаванняў, распрацовак і вытворчасці пратэіназа К патрабуюцца спецыялізаваныя вытворчыя плошчы, абсталяванне і персанал.
Раствор пратэіназы K ад XD BIOCHEM
XD BIOCHEM мае развітую платформу экспрэсіі і ачысткі бялкоў, а таксама багаты вопыт у экспрэсіі і ачыстцы рэкамбінантных бялкоў і аптымізацыі вытворчых працэсаў. Дзякуючы хуткаму фарміраванню каманды даследнікаў і распрацоўшчыкаў, быў пераадолены маштабны вытворчы працэс пратэіназы К. Штомесячная вытворчасць ліафілізаванага парашка складае больш за 30 кг. Прадукт мае стабільную прадукцыйнасць, высокую спецыфічную актыўнасць ферментаў і не ўтрымлівае рэшткаў цытахрому і нуклеінавых кіслот гаспадара. Звяжыцеся з XD BIOCHEM. Атрымайце пробны пакет (электронная пошта:sales@xdbiochem.comТэл.: +86 513 81163739).
Тэхнічныя рашэнні XD BIOCHEM ўключаюць
З дапамогай шматкопійнай інтэграцыі плазмід адбіраюцца штамы з высокай экспрэсіяй і ўзроўнем экспрэсіі 8 г/л, што пераадольвае праблему нізкага ўзроўню экспрэсіі пратэіназы К.
Дзякуючы шматэтапнаму працэсу ачысткі, рэшткі цытахрому гаспадара і нуклеінавых кіслот пратэіназы К былі паспяхова выдалены ніжэй за стандартнае значэнне.
Дзякуючы высокапрадукцыйнаму скрынінгу ахоўных буферных складаў быў абраны буфер, які можа стабільна захоўваць пратэіназу К пры тэмпературы 37°C.
Скрынінгавыя буферы вырашаюць праблему лёгкай агрэгацыі і асадка пратэіназы К пры высокіх канцэнтрацыях, і закладваюць аснову для сублімацыі пратэіназы К з высокім утрыманнем цвёрдых рэчываў.
Узор пратэіназы K XD BIOCHEM
Тэст стабільнасці пратэіназы K XD BIOCHEM: пасля 80 дзён пры пакаёвай тэмпературы істотных змен актыўнасці не будзе.
Тэст стабільнасці пратэіназы K XD BIOCHEM: пасля 80 дзён пры пакаёвай тэмпературы істотных змен актыўнасці не будзе.
Параўнанне эфекту экстракцыі нуклеінавых кіслот з дапамогай пратэіназы K XD BIOCHEM і канкуруючых прадуктаў. У працэсе экстракцыі нуклеінавых кіслот выкарыстоўваюцца адпаведна XD BIOCHEM і канкурэнтная пратэіназа K. Эфектыўнасць экстракцыі пратэіназы K XD BIOCHEM вышэйшая, а значэнне Ct мэтавага гена ніжэйшае.
Час публікацыі: 31 снежня 2021 г.