ІПТГ (ізапрапіл-β-D-тыягалактазід) — гэта аналаг субстрата β-галактазідазы, які мае высокую індуцыбельнасць. Пры індукцыі ІПТГ індуктар можа ўтвараць комплекс з бялком-рэпрэсарам, у выніку чаго канфармацыя бялку-рэпрэсара змяняецца, і ён не можа злучацца з мэтавым генам, што прыводзіць да эфектыўнай экспрэсіі мэтавага гена. Дык як жа вызначыць канцэнтрацыю ІПТГ падчас эксперыменту? Чым большая, тым лепш?
Спачатку давайце разбярэмся ў прынцыпе індукцыі IPTG: лактазны оперон (элемент) E. coli змяшчае тры структурныя гены, Z, Y і A, якія кадуюць адпаведна β-галактазідазу, пермеазу і ацэтылтрансферазу. lacZ гідралізуе лактозу на глюкозу і галактозу або на алалактозу; lacY дазваляе лактозе з навакольнага асяроддзя праходзіць праз клеткавую мембрану і трапляць у клетку; lacA пераносіць ацэтыльную групу з ацэтыл-КоА на β-галактазід, што прадугледжвае ліквідацыю таксічнага эфекту. Акрамя таго, ёсць аперацыйная паслядоўнасць O, пачатковая паслядоўнасць P і рэгуляторны ген I. Код гена I - гэта рэпрэсарны бялок, які можа звязвацца з пазіцыяй O аператарнай паслядоўнасці, так што аперон (мета) рэпрэсуецца і выключаецца. Існуе таксама сайт звязвання для катабалічнага актыватарнага бялку гена - сайта звязвання CAP вышэй за ініцыяцыйную паслядоўнасць P. Паслядоўнасць P, паслядоўнасць O і сайт звязвання CAP разам утвараюць рэгуляторную вобласць lac-аперона. Кадавальныя гены трох ферментаў рэгулююцца адной і той жа рэгуляторнай вобласцю для дасягнення каардынаванай экспрэсіі генных прадуктаў.
Пры адсутнасці лактозы lac-аперон (мета) знаходзіцца ў стане рэпрэсіі. У гэты час lac-рэпрэсар, які экспрэсуецца паслядоўнасцю I пад кантролем прамотарнай паслядоўнасці PI, звязваецца з паслядоўнасцю O, што перашкаджае звязванню РНК-палімеразы з паслядоўнасцю P і інгібіруе ініцыяцыю транскрыпцыі; пры наяўнасці лактозы можа індукаваць lac-аперон (мета). У гэтай сістэме аперона (мета) сапраўдным індуктарам не з'яўляецца сама лактоза. Лактоза трапляе ў клетку і каталізуецца β-галактазідазай, ператвараючыся ў алалактозу. Апошняя, як малекула індуктара, звязваецца з бялком-рэпрэсарам і змяняе канфармацыю бялку, што прыводзіць да дысацыяцыі бялку-рэпрэсара ад паслядоўнасці O і транскрыпцыі. Ізапрапілтыагалактазід (IPTG) мае такі ж эфект, як і алалактоза. Гэта вельмі магутны індуктар, які не метаболізуецца бактэрыямі і вельмі стабільны, таму шырока выкарыстоўваецца ў лабараторыях.
Як вызначыць аптымальную канцэнтрацыю IPTG? Возьмем, напрыклад, кішачную палачку.
Генетычна мадыфікаваны штам E. coli BL21, які змяшчае станоўчы рэкамбінантны pGEX (CGRP/msCT), быў перасеяны ў вадкае асяроддзе LB, якое змяшчае 50 мкг·мл-1 Amp, і культываваўся на працягу ночы пры тэмпературы 37°C. Вышэйпаказаную культуру перасеялі ў 10 бутэлек па 50 мл свежага вадкага асяроддзя LB, якое змяшчае 50 мкг·мл-1 Amp, у суадносінах 1:100 для пашырэння культуры, і калі значэнне OD600 складала 0,6~0,8, дадавалі IPTG да канчатковай канцэнтрацыі. Яна складала 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1. Пасля індукцыі пры той жа тэмпературы і ў той жа час з яго адбіралі 1 мл бактэрыяльнага раствора, бактэрыяльныя клеткі збіралі цэнтрыфугаваннем і падвяргалі SDS-PAGE для аналізу ўплыву розных канцэнтрацый IPTG на экспрэсію бялку, а затым выбіралі канцэнтрацыю IPTG з найбольшай экспрэсіяй бялку.
Пасля эксперыментаў высветлілася, што канцэнтрацыя IPTG не максімальна высокая. Гэта звязана з тым, што IPTG валодае пэўнай таксічнасцю для бактэрый. Перавышэнне канцэнтрацыі таксама прывядзе да гібелі клеткі; і, як правіла, мы спадзяемся, што чым больш растваральнага бялку экспрэсуецца ў клетцы, тым лепш, але ў многіх выпадках, калі канцэнтрацыя IPTG занадта высокая, утвараецца вялікая колькасць уключэнняў у арганізме, але колькасць растваральнага бялку памяншаецца. Такім чынам, найбольш прыдатная канцэнтрацыя IPTG часта не чым большая, тым лепш, а чым ніжэйшая канцэнтрацыя.
Мэта індукцыі і культывавання генетычна мадыфікаваных штамаў — павялічыць выхад мэтавага бялку і знізіць выдаткі. На экспрэсію мэтавага гена ўплываюць не толькі ўласныя фактары штама і экспрэсійная плазміда, але і іншыя знешнія ўмовы, такія як канцэнтрацыя індуктара, тэмпература індукцыі і час індукцыі. Таму, як правіла, перад экспрэсіяй і ачысткай невядомага бялку лепш за ўсё вывучыць час індукцыі, тэмпературу і канцэнтрацыю IPTG, каб выбраць адпаведныя ўмовы і атрымаць найлепшыя эксперыментальныя вынікі.
Час публікацыі: 31 снежня 2021 г.