Дытыятрэйтол (ДТТ) — гэта распаўсюджаны аднаўляльнік, таксама вядомы як новая зялёная дабаўка. Гэта нізкамалекулярнае арганічнае злучэнне з двума меркаптанавымі групамі (-SH). Дзякуючы сваім аднаўляльным уласцівасцям і стабільнасці ДТТ шырока выкарыстоўваецца ў біяхіміі і малекулярна-біялагічных эксперыментах.
Асноўная роля ДТТ заключаецца ў аднаўленні дысульфідных сувязей у бялках і іншых біямалекулах. Дысульфідная сувязь з'яўляецца важнай часткай згортвання і стабільнасці бялку, але пры пэўных эксперыментальных умовах, такіх як аднаўляльны SDS-PAGE аналіз, рэкамбінацыя і згортванне бялку, неабходна аднавіць дысульфідную сувязь да дзвюх тыяльных груп, каб раскрыць прасторавую структуру бялку. ДТТ можа рэагаваць з дысульфіднымі сувязямі, аднаўляючы іх да меркаптанавых груп, тым самым адкрываючы прасторавую структуру бялку і палягчаючы яго аналіз і маніпуляцыі.
ДТТ таксама можа выкарыстоўвацца для абароны актыўнасці і стабільнасці фермента. У некаторых рэакцыях, каталізаваных ферментамі, актыўнасць фермента можа быць зніжана акісляльнікам. ДТТ можа рэагаваць з акісляльнікамі, аднаўляючы іх да бясшкодных рэчываў, тым самым абараняючы актыўнасць і стабільнасць фермента.
У параўнанні з традыцыйнымі аднаўляльнікамі, такімі як β-меркаптаэтанол (β-МЭ), ДТТ лічыцца больш бяспечным і стабільным аднаўляльнікам. Ён не толькі стабільны ў водным растворы, але і захоўвае свае аднаўляльныя ўласцівасці пры высокай тэмпературы і кіслотна-шчолачных умовах.
Выкарыстанне DTT адносна простае. Як правіла, DTT раствараецца ў адпаведным буферы, а затым дадаецца ў эксперыментальную сістэму. Аптымальная канцэнтрацыя DTT павінна вызначацца ў адпаведнасці з канкрэтным эксперыментам і звычайна выкарыстоўваецца ў дыяпазоне 0,1-1 мМ. Больш нізкія канцэнтрацыі могуць паменшыць неспрыяльны ўплыў на рост клетак і знізіць цытатаксічнасць з-за празмернай экспрэсіі мэтавых бялкоў. Больш высокія канцэнтрацыі могуць выклікаць празмерную метабалічную нагрузку клетак, што ўплывае на рост клетак і эфектыўнасць экспрэсіі.
Спосабам вызначэння аптымальнай канцэнтрацыі можа быць ацэнка ўзроўню экспрэсіі мэтавага бялку шляхам правядзення індукцыйных тэстаў IPTG пры розных канцэнтрацыях. Тэсты ў невялікіх культурах можна праводзіць з выкарыстаннем дыяпазону канцэнтрацый IPTG (напрыклад, 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ і г.д.), а эфект экспрэсіі пры розных канцэнтрацыях можна ацаніць шляхам выяўлення ўзроўню экспрэсіі мэтавага бялку (напрыклад, вестэрн-блот або флуарэсцэнтная дэтэкцыя). Згодна з эксперыментальнымі вынікамі, у якасці аптымальнай канцэнтрацыі была абрана канцэнтрацыя з найлепшым эфектам экспрэсіі.
Акрамя таго, вы можаце звярнуцца да адпаведнай літаратуры або вопыту іншых лабараторый, каб зразумець звычайна выкарыстоўваны дыяпазон канцэнтрацый IPTG у падобных эксперыментальных умовах, а затым аптымізаваць і карэктаваць у адпаведнасці з эксперыментальнымі патрэбамі.
Важна адзначыць, што аптымальная канцэнтрацыя можа адрознівацца ў залежнасці ад розных сістэм экспрэсіі, мэтавых бялкоў і эксперыментальных умоў, таму лепш за ўсё аптымізаваць яе ў кожным канкрэтным выпадку.
Карацей кажучы, ДТТ — гэта распаўсюджаны аднаўляльнік, які можа быць выкарыстаны для аднаўлення дысульфідных сувязей у бялках і іншых біямалекулах, а таксама для абароны актыўнасці і стабільнасці ферментаў. Ён шырока выкарыстоўваецца ў біяхіміі і малекулярна-біялагічных эксперыментах.
Час публікацыі: 28 верасня 2023 г.